ELISA常见问题
在检测中对照是为了说明检测结果的有效性,空白是为了验证各反应元素,如一抗与二抗,抗原与二抗是否存在非特异性结合,如果OD 很低的话(OD490 一般小于0.1),可以证实反应系统的非特异性低,为抗原与抗体、二抗的最佳结合条件。阳性对照,主要是验证反应系统在当前反应条件下是否发生了特异性反应,避免发生假阴性。ELISA 空白对照:前面所有的试剂都不加,只加最后读版时的底物溶液和终止液(如果有的话)。它的意义是将所有检测的OD 值减去试剂本身的OD 值(空白对照)。空白对照分两种,一种如上所述的,是显色空白对照,用于防止显色剂污染引起的实验差错,另一种是实验步骤对照,用以校准elisa 实验步骤和系统的,如果系统设计不好,本底偏高,这时就需要空白对照来校准,即最后OD 值减去空白对照值。
空白对照有几种
1. 空气空白\水空白: 一般是用于仪器调零的,所有孔数值减掉该孔数值
2.底物空白: 一般是用于防止底物弱显色所造成的读数偏高,同样所有孔数值减掉该孔数值
3. 酶空白: 一般在2 步法实验中使用,主要是看酶是否和板有非特异性结合的,一般不做这个在加样品之前考虑封闭一下,可以用1%bsa。洗的时间稍微延长一下.
停留1min.
1 对于新手,经常遇到Elisa 板上面全是兰色(假设我们底物是用TMB).即阳性,阴性无差异性.解析:主要原因:⑴封闭.没有封闭好.可能是时间太短或浓度太小⑵血清.阴性血清浓度大,里面的杂蛋白量就多了,与封闭液反应.然后再与2 抗反应,所以阴性结果OD 值比较高.还有一个可能就是你的血清稀释的浓度过高引起.⑶二抗 二抗浓度高,使阳性、阴性同时升高⑷操作方法 注意洗涤时一定要洗干净.
2 有时我们还会遇到Elisa 板上面没有颜色.
解析:主要原因:⑴封闭液浓度过高 使得封闭液把所有位点全部占用.阻止了血清与包被液的结合.⑵二抗 有可能是二抗长时间放置,效价降低.你做实验时还是按照你以前的浓度计算的结果.
ELISA 常见问题
ELISA 方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA 测定中影响因素较多,而且其操作中有一定的技术要求,在检测过程中除正常反应外,有时常见到一些错误的结果。引起ELISA 测定错误结果的原因主要有:①标本因素;②试剂因素;③操作因素。下面就一些常见ELISA 操作过程中的问题一一分析。
1.样品稀释
酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应,如果血清不稀释,不可避免会产生很强的非特异性反应,出现假阳性。因此,国外检测血清抗体的试剂盒,均规定将血清稀释至适当的倍数,以降低非特异性反应,使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定,以保证试验的灵敏度和特异性。但是,有些用户未能严格按使用说明书操作,如某些产品应取10μl 样品进行稀释,个别用户取5μl 甚至1μl 样品进行稀释,由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够,因此造成样品稀释倍数不准确,检测结果出现问题。
2.试剂盒平衡
试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25℃),一般需在室温放置20~30 分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够,样品孵育时间相对缩短,ELISA 反应不够充分。冬季室温低,可将试剂盒置37℃温箱20 分钟。
3.样品和试剂的混匀
稀释前、后的样品必须充分混匀,所有试剂在加样前也须摇匀,以保证试验的均一性。
4.加样
在现在的ELISA 商品试剂盒中,必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是:加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡。加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区,易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以,有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性,下次测定为阴性,往往就是上述加样及试剂的错误所致。
5.温育
温育是ELISA 测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA 作为一种固相免疫测定,抗原抗体的结合反应在固相上进行,要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合,必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比,即温度越高,则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃。一些操作者,擅自改变说明书操作,使用自己喜欢的温育时
间和温育温度,这样造成一些不必要的麻烦。因为,不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择,随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。
6.洗板
固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术,需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来,以保证ELISA 测定的特异性。洗板对于ELISA 测定来说,也是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外;加洗液后要静置1 分钟,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干;及时更换吸水纸,尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去,否则可能影响试验结果。
7.边缘效应
使用96 孔板的ELISA 测定中,常发现有“边缘效应”,即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体,在实验室的常规ELISA 测定中,将板从室温(通常在25℃左右)置于37℃温箱,板也升温时,在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时,将板和溶液均加热至温育温度(如37℃),就可以很容易地排除“边缘效应”,并且可提高测定的重复性。
8.显色
显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。一般来说,显色时间过短,结果偏低;显色时间过长,空白增高或者非特异性显色增加。
9.比色
比色要注意波长的选择。以TMB 为底物和以OPD 为底物的试剂盒均有使用,而前者比色波长为450nm,后者为492nm,滤光片需根据要求随时更换。因此,容易出现滤光片错用的问题。其次,单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如
450nm 或492nm 进行比色测定;而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm 和非敏感波长如630nm 下各测定一次,敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和;非敏感波长下测定即改变波长至一定值,使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零,此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此,双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA 测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性,也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值,
故而在ELISA 测定比色时,最好是使用双波长比色。__